Gegründet wurde die Gemeinschaft vor den Toren Akkons im Jahre 1190 als Hospitalbruderschaft, aus der dann sehr schnell ein Ritterorden wurde. Es folgte eine rasche Ausbreitung rund um das Mittelmeer und bis nach Preußen und ins Baltikum, wo ein eigener Ordensstaat entsteht. Dort wird nach dem Fall des Heiligen Landes (1291), nachdem Venedig für 18 Jahre Sitz des Ordens war, auf der Marienburg (später Königsberg) der Hauptsitz des Ordens errichtet. Nachdem 1525 der Ordensstaat säkularisiert wurde, erfolgte eine Neuausrichtung und Erneuerung der Regel (1606) vom neuen Sitz des Hochmeisters in Mergentheim.

Der Orden war ab der Reformation bis ins 19 Jh. hinein trikonfessionell (katholisch, lutherisch, calvinistisch), jedoch stets mit einem katholischen Hochmeister, der in der Regel einem der führenden Herrscherhäuser entstammte. Im 17. Jahrhundert begründete einer dieser Hochmeister auch das Regiment „Hoch- und Deutschmeister“. Die erste Niederlassung in Österreich bildete 1203 die Übertragung des Magdalenenhospitals in Friesach, gefolgt vom heutigen Hauptsitz im Zentrum von Wien zwischen 1204 und 1206. Weitere Niederlassungen folgten und werden teilweise bis heute ununterbrochen vom Orden betreut.

Tiefe Veränderungen brachte der Friede von Pressburg 1805, der den Orden dem Kaiser anheim stellte, die Aufhebung in den Rheinbundstaaten durch Napoleon 1809 und das Ende des Ersten Weltkriegs, der das Ritterinstitut obsolet machte. In den 1840er Jahren erfolgte die Wiedererrichtung des Schwesterinstituts durch Hochmeister Maximilian-Josef von Habsburg-Este, dann die geistliche Erneuerung des Ordens maßgeblich durch den Ordenspriester Peter Paul Rigler und die Rückbesinnung auf das Ursprungscharisma mittels Errichtung mobiler Feldspitäler. Der 1929 in ein geistliches Institut umgewandelte Orden überstand die tschechische Bodenreform und -enteignung, die Aufhebung durch die Nationalsozialisten und die Unterdrückung durch den Kommunismus. Heute ist er in Österreich, Deutschland, Italien, Slowenien, Tschechien und der Slowakei mit Brüdern, Schwestern und Familiaren vertreten und widmet sich neben der Seelsorge vor allem auch der Sorge um Kranke, Behinderte und alte Menschen.